金黄色葡萄球菌噬菌体vB_Sau_P68的基因组分析和裂解酶

【背景】金黄色葡萄球菌是常见的人畜共患条件致病菌,随着多耐药菌株分离率的增长,研发与抗生素作用模式不同的抗菌剂迫在眉睫。【目的】分离高效且特异性强的金黄色葡萄球菌噬菌体,对其进行功能注释,并对其编码的裂解酶进行功能验证。【方法】通过对噬菌体全基因组序列进行分析找到裂解酶基因,利用原核表达系统对其编码的2个裂解酶蛋白进行克隆,用SDS-PAGE与蛋白免疫印迹法(Western blotting)鉴定目的蛋白是否表达,并采用单斑法验证其裂解活性。【结果】本研究的噬菌体为一株新的金黄色葡萄球菌噬菌体,命名为vB＿Sau＿P68,该基因组全长为139 409 bp,GC含量为31.0%,编码220个开放阅读框(open reading frame,ORF),透射电镜观察具有正二十面体头部和收缩性尾部,形态学分类属于肌尾噬菌体。该噬菌体编码2个裂解酶基因,分别具有CHAP催化结构域与SH3＿5结合结构域,SDS-PAGE与Western blotting表明Lys161能够表达且有裂解活性,Lys163则无法外源表达。对Lys161序列进行分析,该裂解酶无信号肽,无跨膜区域,以无规则卷曲为主。【...     

芽胞杆菌拮抗人或动植物病毒的机制研究进展

病毒性疾病严重威胁着人类及动植物的健康。目前正在应用的防治病毒性疾病的方法及其作用有限,开发无毒副作用、生态友好的抗病毒产品防控病毒性疾病非常必要。益生芽胞杆菌可产生核糖核酸酶、胞外聚合物等代谢物或成分,通过增强机体免疫功能等机制发挥抗病毒作用,有望被进一步开发用于病毒性疾病的防治。     

猪源A组轮状病毒重组质粒pW425et-Vp7在乳酸菌中的表达及免疫原性分析

[目的]在乳酸菌中表达猪源A组轮状病毒重组质粒pW425et-Vp7,并检测其抗原性,为进一步制备猪轮状病毒乳酸菌疫苗奠定基础.[方法]摸索电转化条件,将已构建的重组质粒pW425et-Vp7转化至thyA基因缺陷型的嗜酸乳杆菌中.筛选阳性克隆,采用SDS-PAGE和Westernblot检测其表达情况.并将BALB/c小鼠口服免疫该重组菌,间接ELISA检测其免疫原性.另外,给免疫后小鼠攻以纯化的猪轮状病毒(蛋白含量15 mg/mL),初步检测该重组菌的免疫保护作用.[结果]Vp7基因在乳酸菌中获得表达,大小约40.77 kDa,且该蛋白可与猪轮状病毒抗体反应,具有反应原性.ELISA检测小鼠肠黏膜样品结果显示免疫后小鼠能产生明显的抗轮状病毒SIgA抗体,表明该重组菌具有较好的免疫原性.且攻毒后,免疫组仅23%的小鼠发生腹泻,初步证明该重组菌对猪轮状病毒的攻击具有较好的保护作用.[结论]在乳酸菌中成功地表达了猪轮状病毒Vp7基因,制备了猪轮状病毒Vp7重组乳酸菌,该重组菌具有较好的抗原性,初步证明其作为疫苗的可行性.     

人高致病性禽流感病毒H5N1安徽株HA、M2蛋白双顺反子表达载体的构建及表达研究

将我国分离的人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005作为研究对象,扩增其HA和M2基因片段并克隆至DNA疫苗表达载体pVRC中,构建成真核表达质粒。为提高HA的表达量,按照人偏爱密码子将HA基因进行优化改造,经全基因合成后插入真核表达载体pVRC,以β-actin蛋白为内参比证明了优化后的HA蛋白表达效果明显提高。将M2基因和优化后的HA基因共同克隆入双顺反子表达载体pIRES中,获得同时表达HA或M2的双顺反子真核表达质粒;通过Western blot和间接免疫荧光检测方法,确认构建的重组质粒在真核细胞中成功地表达了目的蛋白HA和M2。通过上述结果为进一步开展人高致病性禽流感病毒安徽株HA和M2基因的功能与致病性研究及使用表达HA和M2蛋白进行新型人用禽流感双价疫苗研发奠定基础。     

1株梅花鹿源狂犬病街毒株全基因组测序与分析

对1株梅花鹿源性狂犬病街毒株(DRV)进行全基因组克隆,对全长cDNA进行测序分析.RT-PCR扩增克隆覆盖全基因组9个重叠基因片段,基因组3'和5'末端采取3,-RACE和5'-RACE方法,9个重叠基因片段序列拼接得到DRV全基因组cDNA序列,共11 863个核苷酸.DRV毒株全基因组构成与其他狂犬病毒基因组构成相似,由5个编码区组成,基因起始位点和终止位点高度保守,在核蛋白和糖蛋白的重要抗原位点有个别氨基酸发生变异,对已完成全基因组测序的几个基因1型毒株分别进行了N、P、M、G、L基因核苷酸及氨基酸的同源性比较.与其他具有代表性的毒株进行N基因序列比较建立的系统进化树表明,DRV毒株属于基因1型,与中国人用疫苗株3aG同源性最高为94%,与分类位置未确定的北高加索毒株(WCBV)的同源性最低为71%.本研究结果可为狂犬病毒各项分子生物学研究提供理论参考.     

一株低温木质素降解菌的筛选、产酶优化及酶学性质

【背景】我国北方地区秋冬两季平均气温较低,低温环境使得秸秆更难自然降解。【目的】筛选高效低温木质素降解菌,探索其酶学特性并提高其产酶性能和秸秆降解效率。【方法】通过苯胺蓝法和酶活测定对菌株进行筛选,以Lip、Lac、Mnp酶活力为评价指标,采用单因素和响应面法进行产酶条件优化及酶学性质研究,通过固态发酵试验研究其对秸秆的降解效率。【结果】筛选到一株高效菌LS-1,经形态学和分子生物学鉴定其为嗜麦芽窄食单胞菌。菌株LS-1在木质素为碳源、蛋白胨为氮源、pH 8.0、培养温度15°C、培养时间3 d时产酶效果最佳,其中Lip酶活力为23.34 U/mL、Lac酶活力为9.37 U/mL、Mnp酶活力为50.89 U/mL。Lip和Lac最适作用温度为30°C且热稳定性良好,Mnp最适作用温度为50°C但热稳定性较差。Lac最适作用pH 4.0且耐酸性较好,Lip和Mnp最适作用pH 5.0;0.75 mmol/L Mg~(2+)和0.5%吐温-20对Lip有促进作用,1 mmol/L Cu~(2+)和丁香酸对Lac有促进作用,0.1%-0.5%吐温-20均对Mnp有促进作用。15°C固态发酵后,秸秆失重率达18.85%,木质素降解率达36.14%,比对照组提高约6倍以上。【结论】本研究为低温木质素高效降解提供了优质菌种资源,在秸秆降解方面具有良好的应用前景。     

柔嫩艾美耳球虫重组鸡痘病毒的构建与免疫保护研究

以鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)杂交株F2的RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增了杂交株F2的Rhomboid蛋白家族相关基因,将PCR产物克隆至pMD18-T载体中,构建出克隆质粒pMD-Rhomboid.以KpnⅠ、PstⅠ双酶切重组质粒pMD-Rhomboid和鸡痘病毒载体质粒pUTA2,并将纯化的Rhomboid基因亚克隆至鸡痘病毒载体pUTA2复合启动子下游,构建出真核表达重组质粒pUTA-Rhomboid.采用脂质体转染技术,将该质粒转染FPV282E4株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过BrdU药物加压筛选,并通过RT-PCR和蛋白质印迹等方法检测,筛选出一株球虫鸡痘重组病毒rFPV-Rhomboid.进一步经CEF扩增病毒后,免疫雏鸡,监测免疫指标.结果表明:重组病毒接种鸡外周血中的CD4 、CD8 含量显著高于非免疫对照组(P<0.05);与对照组相比,重组病毒对鸡的增重效果差异显著(P<0.05),对E.tenella的攻击具有一定的保护作用,显示出较好的应用前景.     

流感病毒感染诱导T细胞免疫应答的研究进展

A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)属正粘病毒科流感病毒属,是造成人畜呼吸道感染的重要病原微生物。随着研究的不断深入,国内外不断发现肺脏效应CD4+T细胞、CD8+T细胞和调节性T细胞利用多重效应和调节机制控制IAV感染。本文通过查阅流感病毒介导T细胞免疫反应的有关文献,主要对IAV逃逸T细胞免疫的策略、宿主感染IAV过程中T细胞亚群和固有免疫样T细胞产生的免疫反应等方面展开综述,为国内相关领域的研究提供理论依据。     

库特氏菌属细菌的研究进展

库特氏菌属归属于动性球菌科,属内细菌分布环境多样,在土壤、地表水、野生动物体表、昆虫肠道等处均有检出。近几年,研究者对库特氏菌属的关注度显著增加并且在多个领域发现了其新价值,包括良好的抗逆性和多重降解功能等,同时确定少数菌株具有致病性。目前,仍存在着对属内各降解机制研究均较浅显、从功能的发现到具体应用方案之间缺乏有效衔接等问题亟待解决。对库特氏菌属的建立、分类学特征、属内成员分布、致病性、功能研究与应用等方面进行介绍,以期为该属菌株的分离鉴定、资源开发以及实际应用提供参考。